HPLC
0
komentar
BAB I
PENDAHULUAN
1.1.
Latar Belakang
Kimia
analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk
mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional,
kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis
kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa
kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif bertujuan
untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.
Kimia
analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode.
Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik,
analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan
metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri
massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi, dan
elektrokimia.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra
lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam
nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa
kiral.
Kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC, High Performance Liquid Chromatography) merupakan suatu tekhnis analisis
obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat
dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi.
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan
fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping
proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor
sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam
suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya
dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika
sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Kromatografi
merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu
lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan
cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa
stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat
berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal,
terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair
(Day dan Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan
fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan
pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase
gerak akan bergerak lebih cepat. Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan
dalam memisahkan suatu campuran senyawa.
Berbagai
usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan
teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu
menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid
chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan
kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50
nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar,
2003).
HPLC
didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam
yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit
( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali
dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi
tinggi dan waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi;
lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.
1.2
Tujuan
Tujuan
dari pembuatan makalah ini adalah :
1. Untuk mengetahui
komponen utama dari HPLC.
2. Untuk mengetahui prinsip
kerja dan penerapan dari HPLC.
3. Untuk mengetahui
kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan HPLC.
4. Untuk mengetahui penerapan
HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran
1.3 Rumusan Masalah
1. Bagaimana penerapan HPLC
dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran?
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Perkembangan Kromatografi
Kromatografi
pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan
terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan
fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat
terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang
terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan
adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul
atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).
Istilah
kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T.
Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum,
namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan
tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk
beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan
cair (LSC).
Kemudian
pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938
oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun
1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk
ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi
cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan
kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah
pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih
(Sudjadi, 1986).
Kromatografi
cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase
cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan
terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan
efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak
kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan
dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang
mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000p.s.i). Dalam
metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung
berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang
tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan
jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi
cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).
Kromatografi
cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada
dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur
biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha
dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi
kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau
Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau
Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan
pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan
suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam
keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yangsudah matang dan
dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas
(Putra, 2004).
Umumnya
metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah
contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini
digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi
yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada
kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit
tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan
pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah
laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran
partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair
kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari
kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil,
2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran
dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
HPLC
telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam
penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai
macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas,
dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan
protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah
metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia.
Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance
Liquid Chromatography.
2.2
Teknik Pemisahan dengan HPLC
Tehnik
pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat
atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas
dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju
migrasi masing- masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju
migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan
keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa
diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa
gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu
diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).
Dalam
kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan,
sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom
tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan
analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian
halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang
relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut
pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan
juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai.
Parameter
baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu
retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.
a.
Waktu retensi didefinisikan
sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam
kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi
maksimum.
b.
Faktor kapasitas (k’) juga
merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k’ kecil, maka
komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k’ yang lebih besar,
maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan
dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k’ optimum, yaitu antara 1
sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan
berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan
yang baik maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1., dimana
semakin besar nilai α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat
diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas);
mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan
temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen.
c.
Efisiensi kolom merupakan
kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan
dan dalam waktu yang singkat.
d.
Keterpisahan antara dua
puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi ‘R’ (ukuran besar kecilnya
pemisahan). Jika nilai R ≥ 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.
e.
Sedangkan factor terikutan
(Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf <
2,0.
Perkembangan
HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang
lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan
ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di
dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad
dan Suherman, 1995).
Teknik
HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair– cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif
dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan
umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-
senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa
yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah
sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses
industry.
2.3 Prinsip
Kerja Dari KCKT
Adapun
prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut
dalam fase gerak dan fase diam.
2.4 Kegunaan KCKT
Kegunaan umum KCKT adalah untuk :
pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ;
analisis ketidakmurnian (impurities) ;
analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan
molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak dan
dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
2.5 Mekanisme
Kerja KCKT
Penggunaan
kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam
kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter
kolom, kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.
Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri
atas delapaan komponen pokok yaitu :
1.
Wadah fase gerak
2.
Sistem penghantaran fase gerak
3.
Alat untuk memasukkan sampel
4.
Kolom
5.
Detektor
6.
Wadah penampung buangan fase gerak
7.
Tabung penghubung
8.
Suatu komputer atau integrator atau perekam
Gambar
Rangkaian Instrumen HPLC
1. Wadah fase gerak pada KCKT
Wadah fase gerak harus bersih dan
lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2
liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus dilakukan degassing (penghilangan
gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen
lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada
saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan
pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih
terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat
KCKT (HPLC grade).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya
terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Deret
eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting
dalam pemilihan fase gerak.
Adapun
ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :
1) Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak
terkontaminasi.
2) Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat
yang berfungsi sebagai fase diam.
3) Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.
4) Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok
dengan detektor.
Beberapa
deret eluotropik KCKT :
|
Pelarut
|
Parameter kekuatan
pelarut (adsorbsi)
|
Parameter
kekuatan pelarut (partisi)
|
UV cut off
(nm)
|
|
n-heksana
|
0,01
|
0,1
|
195
|
|
Sikloheksana
|
0,04
|
-0,2
|
200
|
|
Tetraklorometan
|
0,18
|
1,6
|
265
|
Nilai pemenggalan UV merpakan
panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm, pelarut akan memberi
absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk menggunakan
panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang
gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.
Fase gerak yang paling sering
digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer
dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos
alkohol.
3. Pompa
Ada
dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure)
dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat
dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa
reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),
oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor
sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak
terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi
reservoirnya terbatas.
Tujuannya adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat.Ada 2 jenis
pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak
yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.
Syarat
– syarat pompa yang ideal:
a. Mampu
membangkitkan tekanan tinggi
b. Pulse free –
out put
c. Control laju
alir yang akurat
d. Tahan korosi
e. Terbuat dari
bahan yang tahan terhadap fasa gerak
f. Bebas pulsa
g. Perlu“de
gasser”
h. Dapat
menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
i. Dapat
digunakan untuk melakukan elusi gradien
j. Bekerja pada
tekanan sampai 6000 psi (400 atm)
Tiga jenis pompa yang sering
digunakan dalam sistem KCKT yaitu :
1) Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
Jenis pompa yang paling banyak
digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume internalnya kecil sekitar 35
– 400 μl, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi
gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan
akibat dari kekentalan solven.
2) Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
Sistem penggantian menggunakan
sebuah wadah besar seperti syringe dengan sebuah penekan yang digerakan
oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi
kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa
terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
3) Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
Bentuk paling sederhana sebuah
pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas bertekanan tinggi. Harga
relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini.
Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya
sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan
tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.
4. Injektor (penyuntikan sampel)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan
secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup
teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan
bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini
meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah
mempelajarinya).
Pada saat pengisian, sampel digelontor
melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat
penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel
dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini
dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.
Injektor merupakan tempat
untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagaiwaktu retensi. Waktu
retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa
yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi
juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada
kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan
fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung.
Efek
dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang
tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total
waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi
persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak
bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek
sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu
kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat
di bawah ini :
|
Parameter
|
Kolom konvensional
|
Kolom
mikrobor
|
|
Tabung
kolom
|
Stainless
steel
Panjang
3,10,15,20 dan 25 cm
Diameter
luar 0,25 inci
Diameter
dalam 4,6 cm
|
Stainless
steel
Panjang 25
dan 50 cm
Diameter
luar 0,25 inci
Diameter
dalam 1 atau 2 mm
|
|
Fase diam
|
Porous,
silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase),
atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5
atau 10µm dengan kisaran sempit.
|
Porous,
silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau
polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau
10µm dengan kisaran sempit.
|
|
Tekanan
operasional
|
500-3000
psi
(35-215
bar
|
1000-5000
psi
(70-350
bar)
|
|
Fase gerak
|
Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir :
1-3 ml/menit
|
Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir
10-100 µl/menit.Modifikasi instrumen
Sistem
penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah
10µl/menit.Katup injeksi sampekl bervolume kecil;sel detektor bervolume
kecil.
|
|
Kinerja
|
Efisiensi
meningkat dengan bekurannya ukuran partikel fase diam, akan tetapi umur kolom
dengan ukuran partikel 3 µm lebih pendek.
|
Sangat
efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat,konsumsi fase gerak hanya ¼ dari
kolom konvensional.
|
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibandingkan dengan kolom konvensional, yakni :
1.
Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10-100 µl/menit)
2.
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.
3.
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun
untuk tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis
KCKT memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 – 30 cm berbentuk lurus dan
jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4
– 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000
hingga 60.000 lempeng/meternya.
Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan
kecepatan dan kinerja tinggi. Beberapa
kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 – 5 μm. Beberapa jenis kolom
memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm
dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam
pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya
solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).
Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenis pellicular
dan partikel berpori (porous particle). Jenis pellicular terdiri
dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau
polimer dengan diameter 30 hingga 40 μm. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis
polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.
Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter
partikel 3 – 10μm terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena
atau resin penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan
organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
Meskipun demikian, dalam prakteknya,
kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk
analisis rutin.
Berbeda
dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum
dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang
digunakan. Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi
secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam.
Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang dialirkan dengan
bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.
Komponen-
komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang
satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung
dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase
stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga
jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan
kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat.
Terdapat
banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur
dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang
lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang
dianalisis dan viskositas fase gerak yang agak tinggi.
6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT
berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi
atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika adalah polar
dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika yang dimodifikasi secara
kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan bereaksi dengan gugus
silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil reaksi
yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap
hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang
dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan selektifitas yang
berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika (ODS atau C18 )merupakan
fase diam paling sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa
denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.
Solut-solut yang polar, terutama
yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam
silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi antara
solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah
ini dapat diatasi dengan end-chapping yakni
proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan
menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi
(kandungan logam <1ppm)
7.
Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan
dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti
detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor ideal pada sistem KCKT
mempunyai persyaratan :
1) Memiliki sensitifitas yang memadai. Kisaran umum sensitifitas berkisar dari
10-8 hingga 10-15gram zat terlarut per pembacaan
2) Stabil dan memiliki keterulangan yang baik
3) Respon yang linear terhadap kenaikan konsentrasi
4) Waktu respon yang singkat
5) Kemudahan pada penggunaan
6) Memiliki volume internal yang kecil untuk mengurangi pelebaran puncak
Suatu detektor harus mempunyai
karakteristik sebagai berikut :
1.
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2.
Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil.
3.
Stabil dalam pengoperasiannya
4.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8µl atau lebih kecil, sementara
kolom mikrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil lagi.
5.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier).
6.
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa jenis detektor yang digunakan pada sistem KCKT :
1) Detektor
Absorban (UV-Vis)
Pada detektor absorban, aliran akan mengalir melalui detektor dari kolom
kromatografi. Untuk meminimalkan pelebaran puncak, detektor dirancang dalam
volume yang sekecil mungkin. Ukuran volume dibatasi 1 – 10 μl dengan panjang sel 2 – 10 mm. Umumnya sel detektor
mampu menahan tekanan hingga 600 psi sehingga peralatan pengurang tekanan
diperlukan sebelum aliran memasuki detektor.
2) Detektor Fluorescens
Detektor fluorescens yang digunakan sama halnya dengan detektor pada
spektrofluoro-fotometer. Detektor paling sederhana menggunakan lampu merkuri
sebagai sumber cahaya dan filter untuk mengisolasi panjang gelombang emisi
radiasi. Lampu Xenon digunakan pada instrumen yang lebih baik dengan gratting
sebagai monokromatornya.
3) Detektor Refraktif Indeks
Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa
yang melalui sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai
blanko dan sampel secara bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif.
4) Detektor
Elektrokimia
Detektor dengan mendasarkan kerjanya pada pengukuran arus listrik.
Perubahan arus akan dideteksi terhadap waktu dan ditampakkan dalam bentuk
kromatogram. Contoh penggunaan detektor adalah
pada penetapan senyawa tiol dan disulfida.
5) Detektor Spektra Massa
Sejumlah fraksi
kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan
alir 10 – 50 μl per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan,
dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum
massa.
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah
senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran
mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut
menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat
bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
2.6 Jenis – Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
a. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi
adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar.
Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben.
Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan
disebut jugakromatografi fasa normal.
b. Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non
polar. Jenis kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa terbalik karena
fasa geraknya lebih polar daripada fasa diam. Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas
sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena
keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik
analisis rutin.
c. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi
fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak
digunakan saat ini. Dalam hal
penerapann kromatografi fasa terikat dan kromatografi partisi memiliki
persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang
dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil sebaliknya, fasa diam pada
kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi secara fisik dengan
zat cair non polar.
Keuntungan
kromatografi fasa terikat, yaitu :
1) Merupakan fasa yang stabil
2) Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses
pemisahan berlangsung bila kepolaran solut-solut bervariasi.
3) Kolom mempunyai umur panjang.
4) Memiliki
keterulangan waktu retensi yang baik.
5) Lebih ekonomis.
d. Kromatogarfi penukar ion
Kromatografi
penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul
yang dapat diionkan. Ion-ion bersaing dengan ion-ion
fase gerak untuk memperebutkan tempat berikatan dengan fasa diam. Dasar
pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan afinitas senyawa bermuatan
terhadap permukaan penukar ion.
e. Kromatografi ekslusi ukuran
Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi
ekslusi ukuran. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar
pori-pori paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter
pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah volume
terekslusi begitu pula sebaliknya. Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi
distribusi berat molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan
senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih
2.7 Ada 3 sistem KCKT yang
dikenal, yaitu:
1. Sistem elusi isokratik
(isocratic elution)
Sampel diinjeksikan ke dalam
kolom yang komposisi fasa geraknya tidak berubah selama analisis dilakukan
sampai sampel terelusi dari kolom, sistem isokratik yang memiliki nilai k’
(rasio atau koefisien partisi yang bervariasi) akan menghasilkan resolusi yang
buruk dan sukar mendeteksi pita elusinya.
2. Sistem elusi gradient
(gradient elution)
Ada perubahan fasa gerak baik
secara bertahap atau berkesinambungan selama proses berlangsung. Pada mula-mula
elusi, seluruh komponen sampel ditahan di bagian atas kolom, setelah gradien mulai,
kekuatan elusi fase gerak akan meningkat. Pada akhirnya harga k’ akan menjadi
cukup kecil sehingga komponen zat tersebut akan bermigrasi sepanjang kolom
secara cepat sampai ia keluar dari kolom.
3. Sistem elusi bertahap
Baik digunakan untuk sampel yang
mengandung komponen-komponen yang bergerak cepat, yang diikuti senyawa-senyawa
yang lambat gerakannya, tetapi tidak mengandung senyawa dengan nilai k’ setelah
sampai diinjeksikan. Komposisi fase gerak secara bertahap diganti.
Hasil sistem KCKT dan optimasinya
sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain :
a. Temperatur
b. Tekanan
c. Diameter partikel fase diam
d. Viskositas
e. Panjang kolom
Secara sistematik diagram alat
HPLC dapat digambarkan sebagai berikut:
.
2.8 Kelebihan
Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC
Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode
analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan
fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan
dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:
a.
Mampu memisahkan molekul-
molekul dari suatu campuran
b.
Mudah melaksanakannya
c.
Kecepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi
d.
Dapat dihindari terjadinya
dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik
e.
Dapat digunakan bermacam-
macam detektor
f.
Kolom dapat digunakan
kembali
g.
Mudah melakukan
"sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
h.
Dapat
menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC
dilakukan pada suhu kamar.
i.
Dapat
menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
j.
Dapat
menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya
sangat tinggi seperti polimer
k.
Dapat memisahkan zat-zat
yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
l.
Banyak pilihan fasa
geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang
dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
m.
Resolusi : Berbeda dengan
KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat
terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
n.
Kemampuan zat padat
berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
o.
Sensitivitas detektor :
Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar
dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
p.
Detektor- detektor
Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12
gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi,
Radiometri, dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
q.
Kolom yang dapat digunakan
kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan
kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis
solven yang digunakan
r.
Ideal untuk zat bermolekul
besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena
volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.
HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –
zat tersebut.
s.
Mudah rekoveri sampel :
Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif
(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen
sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.
t.
Solvennya dapat dihilangkan
dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.
Sedangkan
kekurangannya adalah:
a.
Larutan harus dicari fase
diamnya terlebih dahulu
b.
Hanya bisa digunakan untuk
asam organic
c.
Harus mengetahui kombinasi yang
optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
d.
Harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
BAB
III
PEMBAHASAN
A. Penerapan HPLC Dalam
Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran
HPLC
sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam
sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi
senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS).
Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik
sulit diperoleh.
Penggunaan
KCKT dalam bidang farmasi
Metode KCKT merupakan metode yang
sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan
atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang
memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah
beberapa contoh penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :
|
Obat (sediaan)
|
Fase diam
|
Fase gerak
|
Detektor
|
|
Adriamisin
(serum)
|
C18
|
Asetonitril-asam
fosfat 0,01 N ph 2,3 (50:50)
|
Fluoresen
EK : 465
nm
EM : 580
nm
|
|
Aktinomisin
(Serbuk)
|
C18
|
CH3CN-H2O
(1:1)
|
Elektrometer
|
|
Allopurinol
(tablet)
|
C18; 4
x 30 cm
|
KH2PO4
0,05M; 1,5 ml/menit
|
UV 254 nm
|
1. Parasetamol:
§ Nama
Kimia : 4- Hidroksiasetanilida
§ Rumus
Molekul : C8H9NO2
§ Berat
Molekul : 151,16
§ Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau,
rasa sedikit pahit.
§ Kelarutan : larut dalam air mendidih dan
dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).
Parasetamol
atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino fenol
yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti
yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan
saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak
menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.
Parasetamol
adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti
C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat
dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam
waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh
tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol
digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.
Pengujian
kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya
HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu
larutan obat yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom
HPLC dengan injektor khusus / syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum
penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan
menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom
dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada
sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap
fasa diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari
kolom daripada solut lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan
yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan adalah
detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap
sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan
mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm.
Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik
karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa
diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam
yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak bereaksi dengan
fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC tentunya
memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang
dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi. Dalam
pengujian parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19
hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra
berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen
yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan
kromatogram ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang
diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan tidak simetris tentunya. Ini
disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC, difusi yang
terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi
longitudinal itu sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama
sedangkan difusi transfer massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak
merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen
yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran
partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter-
parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram
seperti pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram
mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam
kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin
sulit dipisahkan secara efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi
(ppm) dapat dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh
menunjukkan bahwa dari sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol
sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg
diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar 615,9836 mg. Dapat
disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98 mg
per tabletnya.
2. Kafein
Rumus struktur :
§ Nama
Kimia : 1,3,7-Trimetil xantin
§ Rumus
Molekul : C8H10N4O2
§ Berat
Molekul : 194,19
§ Pemerian : serbuk putih atau bentuk jarum
mengkilat putih, biasanya menggumpal, tidak berbau, rasa pahit.
§ Kelarutan
: Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar
larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).
Dalam
penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC yang
digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer,
Kolom : Supelcosil LC : 18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat
70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak. Proses pengerjaan terdiri dari 2
tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.
ANALISIS KUANTITATIF
Metoda Persentase Tinggi /
Lebar Puncak
Metoda ini disebut juga
Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar
atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi
zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau
tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau
tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total). Hasil normalisasi
dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang
dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:
|
No
|
Peak
area
|
|
|
Kafein
standar
|
Kafein
dalam sampel
|
|
|
1
|
2601417,40
|
2216635,31
|
Berdasarkan data table
diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis dengan
mengunakan persamaan :
Cx
= Ax / Ap X Cp
= x
200 ppm
=
170,42 ppm
Maka dalam 1 mL sampel yang
diuji terdapat 0,17042 mg kafein.
Ada dua masalah dengan pendekatan
ini, yaitu:
Kita
harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen
muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-komponen
dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi.
Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk
setiap komponen
Untuk
mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.
Kafein
berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan
mengantuk, juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi
otak dan suasana jiwa diperbaiki. Kofein juga memperkuat kontraksi jantung,
vasodilatasi perifer dan diuretis. Kofein digunakan sebagai penyegar. Zat ini
sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk memperkuat efek
analgetisnya.
Kafein
dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi
diperlukan untuk memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis
letal sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir kopi) yang menimbulkan aritmia
jantung. Kematian karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi, iritabel dan
sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih dari 600 mg
kopi per hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek,
2001).
BAB III
PENUTUP
3.1
Kesimpulan
a. Komponen utama dari HPLC
yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector, pengolahan data.
b. Prinsip dasar HPLC (High
Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan
kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC
sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam
sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam
suatu campuran.
c. HPLC sebagai suatu
metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan pemisahan yang
sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak
tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis,
dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi
pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya
terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui
kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya
mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
3.2
Saran
Penulis
berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab isi dapat dijadikan
referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya
dan dapat menerapkannya secara tepat dengan tujuan memajukan pendidikan di
Indonesia.
DAFTAR
PUSTAKA
Ahmad,
M., dan Suherman 1995. Analisis
Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.
Ahmad,
M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi. Airlangga University Press. Surabaya.
Bahti.
1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika.
Universitas Padjajaran. Bandung.
Bassett,
J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, Penerbit Buku Kedokteran EGC,
Jakarta.
Day,
R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis
Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar,
S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik,
UI Press, Jakarta.
Putra,Effendy
D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan
Alam Universitas Sumatera Utara :3
Sudjadi,
1986. Metode Pemisahan. Kanisius.
Yogyakarta.
